مقایسه تورین با مهار کننده‌های آنزیم میلوپراکسیداز در فرایند تغییر لیپوپروتئین کم تراکم توسط اسید هیپوکلروس

دکتر هادی خرازی  * ؛ دکتر جورج شاور **

چکیده :

سابقه و هدف :تورین اسید آمینه گوگرد داری است که احتمالاً از روند خودتخریبی سلول‌ها طی فرایند تولید مواد اکسیدان نظیر اسید هیپوکلروس (HOCl)جلوگیری می‌نماید. مطالعه حاضر با هدف مقایسه تورین با مهارکننده‌های آنزیم میلوپراکسیداز (MPO) در فرایند تغییر لیپوپروتئین کم تراکم (LDL)  ایجاد شده توسط HOCl انجام شده است.

مواد و روش‌ها : مطالعه به روش  آزمایشگاهی با استفاده از خون تعدادی  اهداکننده با سطح لیپید طبیعی انجام گرفت. بر این اساس دو عملیات ذیل را مورد توجه قرار دادیم : مهار عملکرد نوتروفیل‌ها با جلوگیری از تولید اکسیدا‌ن‌ها توسط MPO ، با به‌کارگیری مواد مختلف شیمیایی نظیر آمینو1 ، 2 ، 4  تریازول ، سیانید پتاسیم و خنثی سازی یا متوقف‌ساختن ترکیبات حاصله از نوتروفیل‌های فعال شده نظیرHOCl  مشتق از MPO با استفاده از اسیدهای آمینه متیونین، تورین و گلیسین. بدین منظور تخریب تریپتوفان در حضور سیستم MPO  با استفاده از تکنیک فلوریمتر ارزیابی شد و از این روند به عنوان شاخصی برای تغییر LDL استفاده گردید .

یافته‌ها : تورین  در غلظت 40 میکرومولی که 3 برابر کمترازغلظت فیزیولوژیک آن است، در مقایسه با حالت شاهد
(عدم وجود تورین) 50 برابر t_max/2 طولانی‌تر گردید (20دقیقه در برابر 4/0 دقیقه ) . همچنین پاراهیدروکسی بنزوئیک اسید هیدرازید (PHBAH) در محدوده غلظتی 3/0 تا 75/0 میکرومول به‌عنوان یک عامل شیمیایی تأخیردهنده قوی در روند تخریب تریپتوفان مؤثر بود.

بحث : باتوجه به یافته‌ها، تورین  پس از متیونین مؤثرترین خنثی کننده HOCl بوده است و از میان معرف‌ها PHBAH قوی ترین مهارکننده آنزیم میلوپراکسیداز بود؛ بنابراین تورین می‌تواند با اثر خنثی کنندگی بر اکسیدان‌ها در شرایط پاتولوژیک در استراتژی‌های درمانی خاص به‌کار گرفته شود، چرا که بدین جهت از وقوع آسیب در برخی از سلول‌های هدف (نوتروفیل‌ها) توسط اکسیدان‌های قوی کلردار در پروسه بیماری‌های قلبی عروقی جلوگیری نمود.

کلیدواژه‌ها: LDL ، MPO ، تورین ،  PHBAH ،‌HOCl .

** دانشیار بیوشیمی انستیتوبیوشیمی و بیولوژی مولکولی دانشگاه گراتس – اطریش.

عهده دار مکاتبات: کرمانشاه، باغ ابریشم، بلوار شهید شیرودی، دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی،‌گروه بیوشیمی،
تلفن: 8367334-0831.                                                                                           h_kharrazi@yahoo.com Email:

مقدمه :

اسید آمینه تورین(Taurine) در بسیاری از بافت‌های حیوانی به صورت یک اسید آمینه آزاد وجود دارد و در ساختمان پروتئین‌ها و سایر ماکرومولکول‌ها قرار نمی‌گیرد. غلظت‌های بالایی از تورین ( 2 تا 40 میلی مولار) در مغز ، عضله ، قلب ، غدد درون‌ریز، شبکیه و پلاکت‌ها یافت می‌شوند و همچنین مقادیر فوق العاده زیاد آن در سیتوزول سلول‌های التهابی خصوصاً نوتروفیل‌ها وجود دارد. در  لوکوسیت‌ها غلظتی برابر 35 میکرومول از این اسید آمینه گزارش شده است (1). تورین از روند خودتخریبی که در طی فرایند تولید اکسیدان‌ها ایجاد می‌شود، جلوگیری می‌کند(2). نقش تورین در لوکوسیت‌ها  احتمالاً خنثی‌سازی  اکسیدان‌های کلرینه نظیر HOCl می‌باشد(3) . آنزیم MPO یک پروتئین هم دار موجود در گرانولوسیت‌های پلی‌مورفونوکلئوفیلی و مونوسیت‌های فعال شده می‌باشد(4).  این آنزیم در معدود واکنش‌های شیمیایی باعث تغییر در LDL به‌عنوان یک عامل اصلی و عمده و در فرایند تشکیل پلاگ‌های  آتروژنیک، نقش کاتالیزوری دارد(5). یکی از این واکنش‌ها به شکل‌گیری مقادیر قابل‌ملاحظه‌ای از HOCl که قوی‌ترین اکسیدان تولیدشده توسط MPO است، منتهی می‌گردد (6).  این اکسیدان قوی باعث گسترش‌واکنش رادیکال‌های آزاد لیپیدهای موجود درلیپوپروتئین‌ها‌می‌گردد(7و8).

  HOCl همچنین  باعث کلرینه‌شدن آمین‌های موجود در پروتئین‌ها، غیر فعال شدن گروه‌های سولفیدریل (SH) بیرنگ شدن گروه‌های هم و در

نهایت تغییراتی در ساختار پروتئین‌ها از جمله آنزیم‌های  آنتی‌اکسیدانی می‌شود (9  و 10). Stelmaszynska و Lampert دریافتند که HOCl تولیدشده توسط MPO می‌تواند آغازگر فرایند پراکسیداسیون در لیپوپروتئین‌ها و لیپوزوم‌ها باشد(11 و 12).

از آنجاکه آپوپروتئین 100 - B  یکی از مهم‌ترین پروتئین‌های تشکیل‌دهنده ملکول LDL می‌باشد، لذا با قراردادن LDL در معرض  معرف‌هایی همچون هیپوکلریت تولیدشده طی فرایند آنزیماتیک منجر به اکسیداسیون اسیدهای آمینه باقی‌مانده از آپوپروتئین 100 – B خواهد گردید(13).

در مورد آترواسکلروزیس و نقش با اهمیت ماکروفاژها و فاگوسیت‌ها به‌عنوان یک فرایند التهابی در جدار شریانی مطالعات متعددی صورت گرفته است(16-14)، اما در مورد نقش نوتروفیل‌ها در پاتولوژی آترواسکلروزیس مطالعات اندکی انجام شده است(18و 17) . 

این مطالعه به منظور مقایسه تورین با دیگر مهارکننده‌های MPO در فرایند تغییر LDL توسط HOCl انجام گرفته است که در آن با بررسی ویژگی‌های یکی ازترکیبات مشتق از نوتروفیل‌ها یعنی MPO می‌توان مداخلات اختصاصی طراحی‌شده‌ای را در راستای پیشگیری از بروز آترواسکروتیک و سایر بیماری‌های  التهابی در انسان پیشنهاد و اعمال نمود .

مواد و روش‌ها :

در یک مطالعه آزمایشگاهی از تعدادی  اهداکننده خون که شامل مردان و زنان در محدوده سنی 25 تا
      

40 سال و با سطح طبیعی لیپیدی که مدت 14 ساعت ناشتا بودند، در لـوله‌های پروپیلین حاوی EDTA  10 درصد (PH=7/4) خون‌گیری به‌عمل‌آمد. بر این اساس دو عملیات ذیل را انجام دادیم:

1- مهار عملکرد نوتروفیل‌ها با جلوگیری از تولید اکسیدان‌ها توسط MPO، با به‌کارگیری مواد مختلف شیمیایی نظیر آمینو 1 ، 2 ، 4  تریازول ، سیانید پتاسیم، سدیم آزاید، پاراهیدروکسی بنزوئیک اسید هیدرازید و بنزوئیک اسید هیدرازیک  .

2- خنثی سازی و متوقف ساختن ترکیبات حاصل از نوتروفیل‌های فعال‌شده نظیرHOCl   مشتق از MPO با استفاده از اسیدهای آمینه مختلف نظیر متیونین، تورین و گلایسین .

بدین منظور تخریب تریپتوفان در حضور سیستم MPO با استفاده از تکنیک فلوریمتر ارزیابی شد و از این روند به عنوان شاخصی برای تغییر LDL استفاده گردید . برای تعیین  کمی خصوصیات محافظتی، میانگین و انحراف معیار پارامتر tmax/2 برای سه بار تکرار آزمایش محاسبه گردید. برای به‌دست آوردن tmax/2 ابتدا از نمودار روند برحسب زمان tmax/2 استاندارد محاسبه و نمودار روند آن رسم گردید. سپس در مورد تمامی معرف‌ها در  غلظت‌های ثابت این محاسبه تکرار گردید. و نمودار محاسبه میانگین و انحراف معیار tmax/2 برای همه معرف‌ها برحسب غلظت رسم گردید.

آماده سازی مواد :

الف - تهیه پلاسما: پلاسمای تمامی نمونه‌های خونی در سانتریفوژ یخچال‌دار و در دمای 4 درجه سانتی‌گراد جدا شد و با حجم مساوی از محلول سوکروز 60 درصد که غلظت‌ نهایی آن به 6 گرم سوکروز در لیتر پلاسما می‌رسید، مخلوط گردید. سپس  در دمای 80- درجه سانتی‌گراد در تاریکی تا هنگام  آماده سازی LDL حداکثر به‌مدت دو ماه  نگهداری شد (19).

ب- آماده‌سازی LDL : به روشBergmann  صورت گرفت (20). غلظتLDL با استفاده از کیت ساخت بهرینگر – مانهایم و باروش CHOD – PAD تعیین گردید و از ضریب عددی16/3 برای تبدیل میلی‌گرم کلسترول به کل حجم LDL در میلی لیتر استفاده شد .

ج- تهیه معرف‌ها: آنزیم انسانی میلوپراکسیداز

د - تعیین فلورسانس تریپتوفان : از کاهش فلورسانس تریپتوفان تحت تأثیر MPO ، به‌عنوان شاخصی جهت ارزیابی تأثیر ترکیبات خنثی‌کننده  HOCl و مهارکنندگان MPO  در جلوگیری از تغییر پروتئین apo B-100 در LDL  استفاده گردید. LDL  ، فلورسانسی در محدوده اشعه فرابنفش ایجاد می‌نماید که یه‌دلیل 37 مولکول تریپتوفان ‌باقی‌مانده در

واکنش با اضافه نمودن 1/0 میلی مول ازH2O2 ، که روزانه و با رقیق سازی محلول مادر به دست می‌آمد، آغاز می‌شد. تحولات کنیتیکی تغییرات فلورسانس در هر نیم دقیقه اندازه‌گیری شد.

تغییرات LDLدر هنگام فعالیت سیستم MPO/H2O2/Cl- به‌تنهایی‌و یادرحضوراسیدهای‌آمینه خنثی‌کننده HOCl نظیر تورین، متیونین و گلایسین و یا در حضور ترکیبات مهارکننده MPO مثل ATZ، سیانید پتاسیم، سدیم آزاید  SHA، PHBAH و BHA  ارزیابی واندازه‌گیری‌گردید. همه این آزمایش‌ها در شرایط یکسان از جمله حرارت 37درجه سانتی‌گراد در محیط  بافر PBS  با PH=6 و غلظت‌های
  (12/5µg/ml LDL| 0.1µg/ml MPO; 0.1mmol/lH₂O₂) ) صورت پذیرفت .

سیر اختصاصی و مشخص بروز تغییرات در فلورسانس تریپتوفان کاملأ قابل تکرار بوده و عمومأ به صورت  یک کاهش سریع تا حد نزدیک به صفر بوده است. استحاله B-100 apo که با شاخص

تخریب تریپتوفان مشخص می‌شد یک فرایند سریع بودکه در غیاب مهارکنندگان، غالبأ در کمتر از ده دقیقه کامل می‌شد. برای توصیف کمی تغییرات فلورسانس ، پارامتر tmax/2 به عنوان عاملی برای مشخص نمودن تأثیرات محافظتی، معرفی گردید.

tmax/2 عبارت‌است از مدت زمان لازم برای مشاهده یک کاهش 50 درصدی از میزان فلورسانس اولیه . همچنین می توان tmax/2 را به‌عنوان واحد سرعت تخریب تریپتوفان در حین بروز تغییرات ناشی از MPO در LDL دانست.  توضیح این نکته لازم است که برای هرغلظت از تمامی معرف‌های به‌کارگرفته شده در این مطالعه سه بار آزمایش تکرار شده‌است و برای تکرار آزمایش‌های میانگین و انحراف معیار محاسبه گردید. برای دستیابی به نتایح حاصل از این پژوهش از نمودار روند استفاده شد.

یافته‌ها :

وجه مشترک همه آزمایش‌های انجام شده در حضور سیستم MPO/H2O2/Cl- یک الگوی کینیتک عمومی می‌باشد که در منحنی 1 به تصویر کشیده‌شده‌است.
کل میزان کاهش فلورسانس، بدون در نظرگرفتن غلظت به کار رفته تقریباً در مورد تمام مهارکنندگان (به‌جزسدیم آزاید) مساوی بود. تنها براساس مقادیر tmax/2 تفاوت هایی به وجود می‌آید.

تورین، گلایسین و متیونین:

از میان این سه اسید آمینه که اثر تأخیری را بر روند تغییر LDL توسط MPO از طریق خنثی‌سازی 
                                     1. time drive method 

منحنی 1- منحنی کنتیک استاندارد تغییرات فلورسانس تریپتوفان در حضور MPO/H2O2/Cl-و محاسبه tmax/2 بعنوان واحد سرعت تخریب تریپتوفان.

HOCl اعمال می‌کنند، متیونین قوی‌ترین اثر مهاری را داشت  و تورین و گلایسین به‌ترتیب، در رده‌های بعدی قرار گرفتند.

تورین و متیونین در محدوده 10 تا 40  میکرومول ، تخریب تریپتوفان را مهار نموده، به‌نحوی‌که tmax/2 افزایش چشمگیری داشت. در غلظت 40 میکرومول از تورین که 3 مرتبه  زیر مقادیر غلظت فیزیولوژیک این اسید آمینه در بدن می‌باشد، tmax/2 در مقایسه با حالت عدم وجود تورین ، با ضریبی در حد 50 افزایش داشت(20 دقیقه در برابر 4/0 دقیقه). متیونین حتی اثر مهاری قوی‌تری نسبت به تورین نشان داد(ضریب 132)، در حالی‌که گلایسین کمترین اثر (ضریب 13) را دارا بود(منحنی2).

پارا–هیدروکسی‌بنزوئیک‌‌اسیدهیدرازید         (PHBAH):

این ترکیب به عنوان یک عامل مهار کننده عالی در برابر تغییرات apo B-100 ناشی از فعالیت MPO، شناسایی گردید. این ماده در محدوده غلظتی 3/0 تا 75/0 میکرومول، اثر تأخیردهندگی پرقدرتی را نشان داد. در مقادیر غلظتی پایین تر از 3/0 میکرومول تغییرات tmax/2 به سختی قابل اندازه‌گیری بودند(منحنی 3).

اسید سالیسیل هیدروکسامیک SHA)) و اسید بنزوهیدروکسامیک (BHA) :

عملکرد مهارکننده SHA در جلوگیری از تغییر LDL توسطMPO/H2O2/Cl- ، در محدوده غلظت 5 تا 100 میـکرومـول  انـدازه گیری شد (منحنی 4) . در

مقادیر پایین SHA (5 تا100 میکرومول) بروز تغییرات در apo B-100 با سرعت بالایی صورت پذیرفت . با افزایش غلظت مهارکننده در محدوده 20 تا 100 میکرومول tmax/2 به نحوی‌که در منحنی4 نشان داده شده است، افزایش یافت. در مورد BHAنیز نتایج مشابه حالات فوق (SHA) بودند، با این تفاوت که با درجات پایین‌تر رخ می‌دادند .

3-آمینو  1، 2، 4- تریازول (ATZ) :

این ترکیب ضعیف‌ترین تأثیرات محافظتی را در بین مهارکنندگان اثر MPO در ایجاد تغییرات LDL داشته است. ATZ تنها تأخیر کمی در  کنیتیک
واکنش‌ها به‌وجود آورد، به نحوی که در محدوده غلظتی 5/2 تا 50 میکرومول باعث افزایش مختصری در tmax/2 گردید.( منحنی  5).

سیانید پتاسیم و سدیم‌آزاید:

 ارتباط پیوسته بین tmax/2 و غلظت‌های متفاوت سموم هم (Heme) یعنی سیانید پتاسیم و سدیم آزاید در منحنی 5  نشان داده شده است. سیانید پتاسیم  در غلظتی بالاتر از 20 تا 50 میکرومول باعث بروز تأخیری چشمگیر در تغییر LDL گردید . درجه مهارکنندگی این ماده شبیه به تورین بود. گرچه این دو ماده مکانیزم های عملی متفاوتی دارند، درجه عملکرد مهاری سدیم آزاید شبیه به یکی از عوامل متوقف‌سازنده HOCL یعنی گلایسین بود . در غلظت 50 میکرومول سدیم آزاید اثر تأخیری مهمی در زمینه جلوگیری از تغییر LDL توسط MPO بروز نمود. در مقایسه با حالت شاهد که سدیم آزاید وجود

منحنی 5-چگونگی مهار MPO توسط 3-آمینو4،2،1 تریازول (ATZ) ، سیانید پتاسیم و آزید سدیم در حضور سیستم

نداشت،tmax/2 در حضور این‌ماده باضریبی درحدود 21 افزایش نشان داد(5/7 دقیقه در مقابل 35/0
دقیقه ).

بحث:

این پژوهش نشان داد که تورین دومین خنثی‌کننده قوی HOCl حتی در غلظت‌های حدود 40میکرومول است که سه مرتبه کمتر از مقادیر آن در لوکوسیت انسانی است؛ بنابراین فعالیت بیولوژیک MPO وابسته به یون کلر ممکن است تحت کنترل درونزای تورین باشد. tmax/2در حضور تورین 50 برابر  طولانی‌تر از حالت شاهد(عدم وجود تورین) به‌دست آمد ( 20 دقیقه در برابر 4/0 دقیقه ). برخلاف این نتایج Davies و Edwards نشان دادند که گرچه تورین با  خنثی سازی  HOCl لومینسانس شیمیایی سیستم H2O2/HOCl را مهار می سازد، اما این ترکیب تنها اثر کوچکی بر لومینسانس شیمیایی وابسته به سیستم MPO/H2O2 دارد که در توافق با یافته های مطالعه ما نیست (21).

اثر مهاری متیونین قوی‌تر از تورین می باشد، به‌نحوی که tmax/2 در حضور متیونین دو برابر طولانی تر ازtmax/2 نسبت به تورین است. این مطلب را می‌توان با توجه به این واقعیت که متیونین می‌تواند به سه مولکول HOCl متصل شود، توجیه نمود.

شناسایی واکنش مطلوب تورین با  HOCl به مطالعات Grisham و همکارانش باز می‌گردد که مشخص گردید تورین واکنش سریع با HOCl داشته و در نهایت تورین – کلرآمین ( TAU-NHCl )ایجاد می‌گردد)22) که یک‌متابولیت تقریباً غیرسمی و کمتر واکنش‌دهنده بوده و بنا به نظر برخی دانشمندان به عنوان یک ملکول پیام رسان اختصاصی در نوتروفیل‌های فعال‌شده عمل کرده، باعث هماهنگی عمل ماکروفاژها در تولید مدیاتورهای التهابی می‌گردد و ممکن است حداقل به میزان کمی ، باعث محافظت غشاها در برابر آسیب مواد اکسیدان از طریق مهار تولید نیتریت و آلفا- TNF گردد (2). با این‌حال دلیل اهمیت مطالعه تورین نسبت به سایر اسیدهای آمینه این‌است که  در فرایند التهاب حضور این اسید آمینه  بسیار بالاتر از حد مورد انتظار است. از میان ترکیبات مهارکننده عملکرد نوتروفیل‌ها برای جلوگیری از تولید اکسیدان‌ها  توسط MPO می‌توان ATZ را یک مهارکننده ضعیف MPO به شمار آورد، که در عین حال خاصیت مهارکنندگی برای آنزیم کاتالاز را نیز داراست. سدیم آزاید و سیانید پتاسیم در زمینه تعدیل و کندسازی اثرMPO بر apo B– 100 کاملاً مؤثر می‌باشند که به‌دلیل مکانیزم غیراختصاصی‌شان در تأثیرگذاری برتمام پروتئین‌های هم‌دار(Heme)، ارزش درمانی بالایی ندارند (23) . میزان کارایی سیانید پتاسیم در اعمال اثر مهاری و در نهایت جلوگیری از تغییر LDL  مشابه تورین و کارایی مهاری سدیم آزاید معادل گلایسین بود . نمودار تغییرات LDL در حضورهردو ترکیب فوق ، مشابه الگوی کلی کینتیکی شرح داده شده در مورد سایر مهارکنندگان بود . نکته قابل ذکر اینکه در مورد  سدیم آزاید نوعی کاهش وابسته به غلظت در روند تخریب تریپتوفان وجود داشت که احتمالاً در نتیجه غیرفعال‌سازی آنزیم بوده است .

Kettle  و همکارانش یک سلسله مطالعات را روی بنزوئیک اسید هیدرازیدو مشتقات آن انجام داده‌‌اند(24و25)، که دریابند کدام خصوصیات این دسته از ترکیبات باعث مؤثربودن آنان در جلوگیری از تولید HOCl  توسط آنزیم MPO  شده است . این محصول منتج از اکسیداسیون (که احتمالاً یک رادیکال می‌باشد)، به صورت غیرقابل برگشت باعث غیرفعال‌شدن آنزیم می‌گردد . آزمایش‌های ما درمورد PHBAH ، نشان‌دهنده تأثیرات چشمگیر تأخیردهنده این ترکیب در روند تغییر LDL  توسطMPO ، حتی در غلظتی به میزان 3/0 میکرومول بود.

Davies و Edwards در مطالعات خود این نکته را روشن ساختند که SHA هم می‌تواند باعث مهار لومینسانس شیمیایی تولیدشده توسط سیستم سلولی آزاد MPO/H2O2 گردد و هم بر فعالیت پراکسیداتیو MPO خالص‌شده تأثیرات مهاری داشته باشد. غلظت SHA لازم جهت مهار کامل فعالیت MPO ، بین 30 تا 50 میکرومول بود.در آزمایش‌های به عمل آمده در این مطالعه جلوگیری کامل از تغییرات LDL  ناشی از MPO حتی در غلظت 100 میکرومول SHA دیده نشد. احتمالاً دلیل عمده اثر مهاری قوی SHA برMPO، مهار پراکسیداز می‌باشد و خنثی‌سازی  HOCl  تأثیر جزئی را در این‌خصوص موجب می‌گردد(26). SHA و BHA نسبت به یون کلر تمایل بیشتری به اکسید شدن دارندو از اتصال کلر به گروه‌های هم آنزیم جلوگیری می‌نمایند. اتصال SHA سه برابر قوی‌تر از اتصال BHA ارزیابی شده‌است .

نتایج این مطالعه این نظریه را تأیید و تقویت می‌کند که تورین در محیط آزمایشگاهی دارای اثر بالقوه درمانی می‌باشد، چرا که ازوقوع آسیب در برخی از سلول‌های هدف توسط اکسیدان‌های کلرینه قوی جلوگیری می‌نماید.  فرایند خنثی سازی HOCl می‌تواند در شرایط پاتولوژیک با ارزش باشد؛ زیرا که با توجه به آن می‌توان استراتژی‌های درمانی خاص را طراحی نمود و خصوصأ فعالیت طوفانی نوتروفیل‌های فعال‌‌شده را در تولید مواد اکسیدکننده با توقف و تعویق مواجه ساخت.