ارزیابی و مقایسه روش‌های سرولوژیکی ایمونوفلورسانس

غیر مستقیم (IFAT) و آگلوتیناسیون مستقیم (DAT) با

استفاده از آنتی ژن استاندارد شده در تشخیص لیشمانیوز احشایی

داود درستکار مقدم ⁺*(Ph.D.)             سید حسین حجازی **(Ph.D.)                    مهدی قاسمی***(M.Sc.)

چکیده

سابقه و هدف : لیشمانیوز احشایی انسانی (HVL) در استان های فارس و اردبیل به صورت آندمیک و در سایرمناطق کشور به شکل تک‌گیر (Sporadic) گزارش شده است. لیشمانیوز احشایی در ایران از نوع مدیتـرانه ای و عامل آن لیشمانیا اینفـانتوم (L.infantum) و مخـزن آن سگ می‌باشد. این بیماری در ایران بیشتر بچه‌ها را مبتلا می‌کند و در صورت عدم تشخیص زود هنگام، عوارض خطرناکی را پدید می آورد.

مواد و روش‌ها :در این مطالعه با استفاده از آنتی ژن استاندارد شده، روش آگلوتیناسیون مستقیم(DAT) با روش ایمونوفلورسانس غیر مستقیم (IFAT)، مورد مقایسه قرار گرفت. آنتی ژن مورد نیاز| از پروماستیگوت‌های سویه
(MHO/TN/80/IPTi) L.infantum در گروه انگل شناسی دانشکده پزشکی تهیه| استاندارد  و مورد استفاده قرار گرفت. به همین منظور پروماستیگوت‌های لیشمانیا در محیط های کشت N.N.N و RPMI1640 به مرحله تولیـد انبوه رسیـد. مراحل تهیه آنتی ژن DAT به طور کلی شامل تریپسینه شدن، فیکس با فرمالدئید و رنگ آمیزی با کوماسی بلو
(Coomassie blue) می‌بـاشـد. هـم‌چنیـن آنتـی ژن IFAT بـا استفـاده از پـروماستیگـوت‌هـای کشت داده شـده در محیــط

یافته‌ها : نتایج به‌دست آمده، در این مطالعه نشان داد که نسبت سرم‌های مثبت (SPR) Sero-positive rate در روش DAT در ترازهای1:3200 و بالاتر، 4/91 درصد و در روش IFAT در ترازهای 1:80 و بالاتر، 3/94 درصد می‌باشد. Geometric means of reciprocal titer (GMRT) برای روش DAT برابر6309 و در روش IFAT برابر316 به‌دست آمد.

استنتاج: با توجه به ترازهای به‌دست آمده در هر دو روش، تراز 1:3200 روش DAT ارزشی معادل تراز 1:80 روش IFAT دارا می‌باشد.نتایج حاصل از این بررسی نشان داد هر چند که آزمونIFAT  جهت تشخیص بیماران مبتلا به کالا آزار از کارایی خوبی برخوردار است، نیاز به یک آزمایشگاه مجهز می‌باشد؛ در صورتی‌که روش DAT یک روش ساده، ارزان و قابل اجـرا در مناطق روستایی (آندمیک) و جایگزین مطمئن برای روش پر هزینة IFAT می‌باشد.

واژه های کلیدی : آنتی ژن- لیشمانیوز احشایی، آگلوتیناسیون مستقیم، ایمونوفلورسانس غیر مستقیم.

* متخصص گروه انگل شناسی و قارچ شناسی (استادیار) دانشگاه علوم پزشکی اصفهان                      *⁺ اصفهان : خیابان هزار جریب- دانشگاه علوم پزشکی- دانشکده پزشکی

** کارشناس ارشد انگل شناسی- دانشکده پزشکی - دانشگاه علوم پزشکی اصفهان

Eتاریخ دریافت : 17/9/1383            تاریخ ارجاع جهت اصلاحات : 6/11/1381             تاریخ تصویب : 29/4/1384

مقدمه

لیشمانیوز به طیفی از بیماری‌ها اطلاق می‌شود که عامل آن گونه‌های مختلف لیشمانیا Leishmania می‌باشد. این بیماری در شمار بیماری های مشترک انسان و حیوان قرار داشته و بسته به گونة انگل به اشکال مختلف بالینی ازجمله ضایعات پوستی، پوستی- مخاطی، جلدی منتشره و احشایی بروز می‌کند(2،1).

لیشمانیوز احشایی یک عفونت سیستمیک با علایم تب| کاهش وزن| بزرگ شدن طحال و کبد| کم خونی با کاهش تمام عناصر سلولی به ویژه گلبول‌های سفید و افزایش گاماگلوبولین های خون می باشد(6). این بیماری در مناطق وسیعی از جهان گزارش شده است و در 47 کشور دنیا به صورت آندمیک وجود دارد(5،4،3 ).

کالاآزار در ایران در دو استان فارس و اردبیل به صورت آندمیک وجود دارد و در سایر مناطق  به صورت تک‌گیر گزارش شده است(15،11،7).

از آن‌جایی که لیشمانیوز احشایی بیماری خطرناکی می باشد و در صورت عدم تشخیص به موقع و درمان مناسب، می تواند منجر به موارد زیادی از مرگ و میر شود، تشخیص سریع آن می تواند عامل مؤثری در پیش آگهی بیماری به حساب آید.

روش های سرولوژیکی متعددی از جمله IFAT|ELISA|CF|CIEP|aldehyde test برای تشخیص بیماری کالاآزار در مناطق آندمیک و بررسی سرواپیدمیولوژی لیشمانیوز احشایی در انسان و مخازن حیوانی استفاده شده است، ولی این روش ها هر کدام دارای مزایا و معایبی هستند(8 و 9)، مثلاً با وجود این‌که روشCounter-immunoelectrophoresis(CIEP) یک آزمون با ارزش برای تشخیص کالاآزار می باشد، واکنش مثبت کاذب در مواردی همانند بیماری‌های مزمن کبدی، بیماری‌های بدخیم یا خود ایمنی مشاهده شده است(10).

هدف از این مطالعه استفاده از آنتی‌ژن استاندارد شده جهت مقایسة دو روش DAT و IFAT به منظور دست‌یابی به یک آزمون ویژه، آسان، ارزان و قابل اجرا درمناطق روستایی(آندمیک) است تا موارد مثبت کاذب و واکنش متقاطع را کم و یا حذف نموده و به تشخیص زودرس کالاآزار کمک نماید.

مواد و روش ها

این مطالعه یک کارآزمایی بالینی است که در آن 70 نمونه سرم (35 نمونه سرم ا فراد مبتلا به کالاآزار از نظر بالینی از مناطق آندمیک و 35 نمو نه شاهد) مورد بررسی و ارزیابی قرار گرفت.

آزمایش آگلوتیناسیون مستقیم(DAT)

الف)تهیه آنتی ژن DAT

جهت تهیه آنتی ژن، پروماستیگوت های
(MHO/TN/80/IPTi) L.infantum مورد استفاده قرار گرفت. بدین صورت که ابتدا سویه مذکور را درمحیط N.N.N کشت داده و جهت انبوه سازی ا نگل از محیط کشت RPMI 1640 استفاده شد و برای تهیه آنتی ژن به طریق زیر عمل شد:

1- پروما ستیگوت ها با دورg4000 و دمای4 درجة سانتی‌گراد و به مدت 15 دقیقه با سانتریفوژ جدا شد.

2- رسوب به‌دست آمده، پنج بار درمحلول Locke سرد شست و شو داده شده و با دور g3200 و دمای 4 درجة سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شد.

3- محلول تریپسین آماده شده به پروماستیگوت-های متراکم به نسبت یک حجم از پروماستیگوت ها به 20 حجم از محلول تریپسین اضافه شد.

4- محلول به خوبی مخلوط شد تا پروماستیگوت ها به‌صورت سوسپانسیون درآمده و سپس در 37 درجة سانتی‌گراد به مدت 45 دقیقه قرار داده شد.

5- محلول حاصل با دور g3200 به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شده و سپس همانند مرحلة دوم| پنج بار با محلول Locke شست و شو داده شد.

6- رسوب حاصل در محلول Locke سرد به غلظت تقریبی 10⁸×2 سلول در میلی لیتر رسانده شد.

7- مقدار حجم مساوی از فرمالدئید دو درصد به محلول Locke اضافه شده و به مدت یک شب در حرارت 4 درجة سانتی‌گراد قرار داده شد.

8- محلول حاصل با دور g3200 و دمای 4 درجة سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شده و رسوب به دست آمده، با سالین سیترات سرد شست و شو داده شد.

9-جهت رنگ آمیزی کوماسی بلو را با غلظت نهایی 1/0 درصد به آن اضافه کرده و به مدت 90 دقیقه به همان حال قرار داده، و سپس با دور g3200 و به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ کرده و رسوب حاصل، دو مرتبه با سالین سیترات شست و شو داده شد تا رنگ اضافی از بین برود.

10- پس از خالی‌کردن لایه رویی(supernatante ) با استفاده از محلول نگهدارنده (سالین سیترات حاوی
4/0 درصد فرمالدئید) سوسپانسیون یکنواختی تهیه و در دمای 4 درجة سانتی‌گراد و دور از نور تا زمان انجام آزمایش نگه‌داری گردید.

ب - روش انجام آزمایش DAT

در این روش از میکرو پلیت‌های V شکل استفاده گردید. ابتدا رقت های مورد نیاز از سرم بیمار تهیه گردید و پس از افزودن آنتی ژن به رقت‌های مختلف، میکروپلیت را در یک اطاقک مرطوب قرار داده و بعد از 20 ساعت نتایج قرائت می‌گردید.

چنان‌چه انگل‌ها به صورت تکمه‌ای در وسط حفره جمع باشد دلیل بر عدم آگلوتیناسیون و نتیجه از نظر تشخیص آنتی بادی لیشمانیا منفی محسوب می گردد، ولی در صورتی‌که انگل‌ها به صورت ابری شکل ویا به صورت آبی رنگ یکنواخت در تمام مایع در حفره پراکنده گردد و به اصطلاح آگلوتینه شده باشند، نتیجه مثبت محسوب می‌گردد.

روش ایمونوفلورسانس غیر مستقیم(IFAT)

الف)تهیه آنتی ژن

ب) روش انجام آزمون

ابتدا لام‌های حاوی آنتی‌ژن coat شده از فریزر20- سانتیگراد خارج شده و درون دسیکاتور گذاشته شد تا به حرارت آزمایشگاه برسد.

سپس سرم های مورد آزمایش| با رقت های مختلف تهیه و در مجاورت آنتی ژن بر روی لام ریخته شده و برای انجام واکنش به مدت 30 دقیقه در 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد.

یافته‌ها

در این مطالعه 70 نمونه سرم شامل 35 نمونه از سرم افراد مبتلا به کالاآزار و 35 نمونه سرم شاهد با دو روش سرولوژیکی IFAT و DAT مورد آزمایش قرار گرفت.

از مجموع 35 نمونة افراد مبتلا به بیماری کالاآزار 19 نمونة مذکر(3/54 درصد) و 16 نمونه مؤنث (7/45 درصد) بوده اند. همچنین تعداد 27 نفر(1/77 درصد) در گروه سنی9-1 و8 نفر(9/22درصد) درگروه سنی بالاتر از 10 سال قرار داشتند.

در بررسی حاضر تراز 3200/1 و بالاتر برای روش DAT و تراز 80/1 برای روش IFAT به عنوان تراز مثبت در نظر گرفته شد.

در روش IFAT از 35 نمونة مبتلا به کالاآزار 33 نمونه (3/94 درصد) دارای تراز 80/1 و بالاتر و 2 نمونه
(7/5 درصـد) دارای تراز 40/1 بودنـد، ولـی در سایـر نمونه‌های شاهد، پاسخ مثبتی مشاهده نشد. بنابراین در این روش ویژگی 100درصد به‌دست آمد.

بیش‌ترین تراز آنتی بادی مثبت در گروه سنی 5-1 سال و کم‌ترین آن در گروه سنی 15 سال و بالاتر بودند و بالاترین میزان GMRT در گروه سنی 5-1 سال برابر با 690 و کمترین آن در گروه سنی 15 سال برابر با 316 به دست آمد (جدول شماره1).

در روش DAT از 35 نمونة مبتلا به بیماری کالاآزار 32 نمونه(4/91درصد) دارای تراز آنتی بادی 3200/1 و بالاتر و 3 نمونه(4/8درصد) دارای تراز 800/1 بودند. در صورتی که در سایر نمونه های شاهد، هیچ‌گونه تغییری در آن ها مشاهده نگردید. بنابراین ویژگی در این روش 100 درصد به‌دست آمد.

جدول شماره1: توزیع فراوانی تراز آنتی بادی لیشمانیا در روش IFAT بر حسب سن

جدول شماره2: توزیع فراوانی تراز آنتی بادی لیشمانیا در روش DAT بر حسب سن

جهت ارزیابی نتایج دو روش مذکور از جدول توافقی استفاده گردید. بر این اساس از مجموع 35 نمونه مبتلا به بیماری کالاآزار، 32 نمونه با هر دو روش دارای نتایج مثبت و 2 نمونه با هر دو روش منفی بودند؛ در صورتی‌که یکی از نمو نه‌ها با روش DAT منفی ولی با روش IFAT مثبت به دست آمد (جدول شماره 3).

جدول شماره3: جدول دوبعدی(توافقی) ازفراوانی‌آنتی‌بادی لیشمانیا در روش های DAT و IFAT برمبنای ترازمثبت

بحث

روش‌های انگل‌شناسی جهت تشخیص‌آزمایشگاهی لیشمانیوز احشایی خصوصاَ در برخی از مناطق آندمیک بیماری (مناطق روستایی) درکشورهای درحال توسعه که به طور معمول برای انجام چنین آزمایش‌هایی امکانات کافی وجود ندارد، همیشه یک روش عملی و قابل اجرا نمی‌باشد. به علاوه، انگل همیشه در آزمایش‌های میکروسکوپی نظیرگسترش مغز استخوان و یا حتی طحال بعضی ازمبتلایان کالاآزار یافت نمی‌شود؛ به طوری‌که در مناطق آندمیک کالاآزار اردبیل تنها در 69 درصد گسترش تهیه شده مغزاستخوان بیماران مشکوک به کالاآزار که از نظر بالینی با روش DAT سرم مثبت بودند،‌آماستیگوت دیده شده‌است(11).

هم‌چنین از آزمون‌های‌ سرولوژیکی اختصاصی در تشخیص لیشمانیوز احشایی نظیر IFAT| ELISA با نتایج مطلوب استفاده شده است، اما کاربرد چنین روش‌های سرولوژی، نیاز به آزمایشگاه مجهز و تکنیسین‌های ماهر دارد که اصولاَدر مناطق آندمیک کالاآزار که عمدتاَ مناطق روستایی می‌باشند، عملی نمی‌باشد(12).

بنابراین در این مطالعه سعی شد روش سرولوژی DAT که یک روش ساده و اقتصادی در تشخیص بیماری لیشمانیوز احشایی انسانی (HVL) می باشد، مورد ارزیابی و مقایسه با روش IFAT قرار گیرد.

درمطالعه ای که توسط هریت1 و همکاران (1986) با روش DAT انجام شد، ویژگی و حساسیت به ترتیب 100 درصد و 9/98درصدگزارش گردید. حساسیت بالا شاید به خاطر انجام تغییراتی در روش DAT و خصوصاَ رقت و یا غلظت آنتی ژن مورد نظر بوده است(13).

حساسیت و ویژگی روش IFAT در این مطالعه به ترتیب 100درصد و 3/94درصد به‌دست آمدو میزان GMRT نیز در این روش 692 بدست آمد.

 در مطالعه‌ای توسط ایکبال2 و همکاران(2001) با روش IFAT جهت تشخیص مبتلایان به کالاآزار انجام شد، ویژگی 100درصد و حساسیت 93 درصد را نشان داد(17) که این نیز مؤید نتایج حاصله از این مطالعه می‌باشد.

با توجه به نتایج به‌دست آمده با دو روش DAT و IFAT دو نمونه سرم بیماران با روش IFAT دارای عیار1:40 و سه نمونه سرم با روش DAT دارای تیتر1:800 بودند که هر سه نمونه مربوط به مناطق غیر آندمیک بودند.

درمورد سه نمونه فوق باتوجه به این‌که سویه استفاده شده برای آنتی ژن از منطقه آندمیک تهیه شده بود، احتمالاً عدم تطابق بین سایت‌های آنتی ژن با این نمونه‌ها باعث واکنش های سرولوژیک ضعیف و کاهش تراز آنتی بادی اختصاصی شده است.

سایر مطالعات سرولوژی انجام شده بر روی بیماران کالاآزار مناطق آندمیک کشور، بیانگر این است که بیش‌ترین موارد لیشمانیوز احشایی در این مناطق در بچه‌ها دیده می‌شود(15).

نتایج بررسی حاضر نشان داد که برای تشخیص سرولوژی کالاآزار با روش DAT در مناطق روستایی آندمیک وجود یک آزمایشگاه محلی ساده با یک یا دو نفر تکنیسین کفایت می‌کند. هم‌چنین برطبق نتایج به دست آمده به نظر می‌رسد که در مناطق آندمیک کالا آزار، علایم بالینی لیشمانیوز احشایی خصوصاَ در بین بچه‌هایی که تراز آنتی‌بادی آن‌ها با روشDAT، 1:3200 و یا بالاتر می‌باشد مورد خوبی برای درمان اختصاصی این بیماری است.

فهرست منابع

1.                Mandell G.L| Bennett J. E| Dolin R. Principles and Practice of infectious disease| Fifth edition| Philadelphia: Churchill Livingston.2000|5.2831-2836

2.                Pearson RD| Dequeiroz Souza A| Jernomio SMB. Leishmania Species: Visceral (Kaka-Azar)| Cutaneous| and| mucosal leishmaniasis: principles and practice of infectious disease.5^th ed| Philadelphia| Churchill linvingstone| 2000| 2837

3.                W.H.O| Expert committee:Control of the lieshmaniasis| world Health Organ| tech. rep| ser.|1990-793:1-158.

4.                Desjeux.p:The increase in risk factors for leishmaniasis world wide| trans. R. soc. trop. med. hyge. 2001(95): 239-242.

5.                Mahajen RC| Mohan K. Epidemiology of visceralleishmaniasis and control.in parasitology for 21^st century by ozcel MA| Alkan MZ:1996|63-67.

6.                Boelaer T. M|criel. B| Leeuwinber. J| van Dammi.W|le Ray. D| and| Van derstuyft. p: Visceral leishmaniasis control:a public Health perspective. Trans. Roy.soc. Trop. Med. Hyge. 2000(94)| 465-471

7.                Edrisian|GH:visceral leishmaniasis in Iran and the role of serological tests in diagnosis ans epidemiological studies;in parasitology for the 21^st century CAB international| ozcal MA|Alkan MZ: 1996: 63-71.

8.                Sendali. G| Xiao- su. H| Hoessli. D.C| and| Bordior. C. Serological Diagnosis of visceral leishmaniasis by a dot-enzame immunoassay for the detection of a leishmania donovani realated circulating antigrn. J. immunol. methods. 2001| (193): 9-15.

9.                Sinha. R| Sehgal. S. Compatative evaluation of serological tests in India: j.Trop.Med.Hygine. 1997: 333-340.

10.           Mansvetos| Miceli. MD| Lacascia. C| Picore DM. Further observations on the use of Countercurrent electrophoresis (CIEP) on cellulose acstate membrane (cello gel) in the diagnosis of Visceral leishmaniasis. Qouad Sclavo Diagn. 1998| 16(3)|258-266.

11.           Soleiman- zadeh G| Edrissian GH| movahed AM: Epidemiological Aspect of kala-azar in Meshkin-shahr| Iran; Human infection bull| wld| Hlth| Org. 1993;71:459-462.

12.           Khorshian S| Hajaran H| Sarkissian MT| etal: Evaluation of Elisa using intact promastigotes as antigen for diagnosis of Visceral leishmaniasis. Irn J Med Sci: 1994; 19: 15-18.

13.           Harith AE| Kolk AHJ| Kager PA| etal: A simple and economical direct agglutination test for serodiagnosis and seroepidemiological studies of Visceral lrishmaniasis. Trans R soc. Trop Med. Hyge;1986; (80);583-587.

14.               Nigro l| Vinic| Romano F| etal: Comparison of indirect immunoflourecent antibody test and the agglutination test for serodiagnosis of Visceral leishmaniasis in HIV infected subjects; Microbiol infect Dis; 1996: 15(10) 832-834.

15.               Edrissian GH| Ahanchi Ar| Gharachati Am| etal: Seroepidemiological studies of Visceral leishmaniasis and for animal reservoirs in Fars province| southern Iran. Iranian journal of Medical Sciences. 1993:18-19.

16.               Harith AE|Kolk AHJ|Kager PA| etal: Evaluation of a newly developed direct agglutination test for serodiagnosis and seroepidemiological studies of Visceral leishmaniasis|comparison with IFAT and Elisa. Trans R Soc trop Med Hyg. 1987; 81: 603-606.

17.               Iqbal. J| Porstam. R| Hira| grover saroj| etal: Visceral leishmaniasis. diagnostic and comparative analysis of three assay. JCM; 2001| 40(2)| 745-749.